Prueba RealPCR para SARS-CoV-2 (COVID-19) de IDEXX

Estudio de validación analítica y especificidad cruzada

Los laboratorios de referencia de IDEXX han desarrollado una nueva prueba de PCR en tiempo real (RealPCR) para detectar el SARS-CoV-2 (COVID-19) basándose en las secuencias genéticas publicadas del virus del brote en humanos. La prueba RealPCR para SARS-CoV-2 (COVID-19) de IDEXX cumple con todos los requisitos de validación analítica. Los estudios de especificidad muestran que la nueva prueba de PCR no tiene reactividad cruzada con los coronavirus veterinarios que afectan comúnmente a los animales de compañía. Asimismo, se ha demostrado que las pruebas RealPCR actualmente disponibles para estos coronavirus veterinarios no detectan ácido nucleico sintético de COVID-19. Las pruebas RealPCR de IDEXX se diseñan y realizan sobre una plataforma de PCR en tiempo real estándar en el laboratorio de diagnóstico molecular (PCR) de West Sacramento, California. Se analizaron más de 4000 especímenes caninos, felinos y equinos con la nueva prueba RealPCR para SARS-CoV-2 (COVID-19) de IDEXX. Se enviaron muestras de pacientes durante un periodo de cuatro semanas a partir del 14 de febrero de 2020. Las muestras utilizadas para el desarrollo y la validación de las pruebas se obtuvieron de muestras enviadas a Laboratorios de Referencia IDEXX para paneles respiratorios de PCR, procedentes de Estados Unidos y Corea del Sur, e incluyeron especímenes de regiones donde actualmente hay casos humanos de COVID-19, como el área de Seattle. Los especímenes se analizaron también en paralelo con tres ensayos de los Centros de Control y Prevención de Enfermedades (CDC, por sus siglas en inglés). IDEXX ha expandido la monitorización a Canadá y países europeos, incluyendo áreas con altas tasas de COVID-19 en la población humana. Hasta mediados de abril, más de 5.000 muestras habían sido analizadas para detectar el virus SARS-CoV-2. Todos los especímenes han sido negativos.

Diseño del ensayo y validación analítica

La prueba RealPCR para SARS-CoV-2 (COVID-19) de IDEXX usa como target el mismo gen de la nucleocápside que se usa en los ensayos del CDC. Este target se basó en el análisis de secuencia que muestra una alta conservación y se adaptó para satisfacer los requisitos de punto de fusión y analíticos de nuestra plataforma estandarizada. Para la validación de la prueba, se utilizó primero el análisis BLAST de secuencias para más de 300 secuencias genéticas públicamente disponibles. Luego se usó un control positivo sintético para validar funcionalmente el rendimiento del ensayo, el cual cumplió los requisitos de alta eficacia de señal/ruido durante la amplificación, reproducibilidad intraserial e interserial, y correlación. Además, IDEXX llevó a cabo tres ensayos del CDC para ejecutarlos en paralelo con el ensayo de IDEXX con fines de confirmación. Los tres ensayos de confirmación se adoptaron del CDC, que los publicó originalmente el 24 de enero de 2020.1,2

La especificidad cruzada de los cuatro ensayos (SARS-CoV-2) se confirmó usando targets de coronavirus veterinario sintético-positivo y especímenes de coronavirus respiratorio canino, coronavirus intestinal canino y felino y coronavirus intestinal equino, positivos con PCR, enviados a través de la oferta de diagnóstico de IDEXX. Se incluyeron en los análisis los siguientes controles durante la fase de validación de PCR en tiempo real y en las pruebas de detección: 

  • Control de extracción negativo (NEC): todos los controles de extracción negativos resultaron negativos con PCR.
  • Control de calidad preanalítico de especímenes usando un ensayo de PCR TaqMan® para un gen de control endógeno. Todos los especímenes, independientemente de ser negativos o positivos, superaron el control de calidad de especímenes.
  • Controles negativos con PCR: todos los controles negativos con PCR resultaron negativos.
  • Controles positivos con PCR: todo los controles positivos con PCR (control sintético-positivo) resultaron positivos.
  • Vigilancia de la contaminación ambiental: todos los especímenes de diferentes ubicaciones dentro del laboratorio de PCR resultaron negativos en el control de contaminación ambiental

Los especímenes de coronavirus respiratorio canino positivo con PCR, coronavirus intestinal canino y felino y coronavirus intestinal equino, enviados a través de la oferta de diagnóstico de IDEXX, también se analizaron contra todos los ensayos para SARS-CoV-2. Todos los ensayos del CDC y los ensayos RealPCR para SARS-CoV-2 (COVID-19) de IDEXX produjeron resultados de otros coronavirus negativos en esta población.

Metodología de las pruebas de detección

Se usaron especímenes seleccionados al azar entre los especímenes enviados a través de la oferta de diagnóstico de la prueba RealPCR de IDEXX para respiratorio canino, respiratorio felino, respiratorio equino, diarrea felina, diarrea canina y diarrea equina. Los especímenes iniciales usados para pruebas de detección incluyeron hisopos (en su mayoría hisopos faríngeos profundos [garganta] y conjuntivales [ojos]) y heces. De los más de 3500 especímenes analizados entre el 14 de febrero y el 12 de marzo:

  • Los especímenes analizados provenían de los 50 estados de USA y de Corea del Sur.
  • El 55% de los especímenes era de caninos, el 41% era de felinos y el 4% era de equinos.
  • El 77% era respiratorio y el 23% era fecal.

 

Referencias

  1. Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. CDC 2019-Novel Coronavirus (2019-nCoV) Real-Time RT-PCR Diagnostic Panel Instructions for Use. CDC publication CDC-006-00019, Revision: 02. www.fda.gov/media/134922/download. Publicación: 15 de marzo de 2020. Último acceso: 16 de marzo de 2020.
  2.  Centers for Disease Control and Prevention, Division of Viral Diseases. Research Use Only Real-Time RT-PCR Protocol for Identification of 2019-nCoV. www.cdc.gov/coronavirus/2019-ncov/lab/rt-pcr-detection-instructions.html. Actualizado el 14 de marzo de 2020 Último acceso: 16 de marzo de 2020.